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走进分子杂交实验
作者:admin

        不同的DNA 片段之间,DNA 片段与RNA 片段之间,如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性,形成新的双螺旋结构。这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。

        基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸(叫做探针)间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA,RNA与RNA,或DNA与RNA之间进行,形成DNA-DNA,RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。

        分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键(主要是氢键)结合,从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH值来实现。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。

 

        以下是几种常见的杂交技术:

 

固相杂交

 

        将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上,一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点,所以最为常用。常用的固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

 

液相杂交

 

        所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,一种研究最早且操作复合的杂交类型,在过去的30年里虽有时被应用,但总不如固相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进,商业性基因探针诊断盒的实际应用,推动了液相杂交技术的迅速发展。

 

固相膜核酸分子杂交

 

菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)

 

        将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA,再烘干固定DNA于膜上,与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。

 

斑点杂交(Dot blotting)

 

        该方法是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(manifolds),如MinifoldI和II、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状,反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。

 

Southern印迹杂交(Southern blotting)

 

        是研究DNA图谱的基本技术,在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后经碱变性,Tris缓冲液中和,高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜(尼龙膜也较常用)上,烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置,从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

 

Northern印迹杂交(Northern blotting)

 

        DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为westernblotting。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似,只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2’-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜,否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB,因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合,为测定片段大小,可在同一块胶上加标记物一同电泳,之后将标记物胶切下,上色、照像。样品胶则进行Northern转印,标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min,在水中就可脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或白炽灯下暴露过久,会使RNA信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时,甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

 

组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)

 

        简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同,菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如,对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置;对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布;与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外,原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。

        用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA,也可以是RNA探针,探针的长度通常以100~400nt为宜,过长则杂交效率减低。2013年研究结果表明,寡核苷酸探针(16~30nt)能自由出入细菌和组织细胞壁,杂交效率明显高于长探针。因此,寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。

发布时间:2019-04-17 周三
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